今天主要有四方面内容和大家分享，NSCLC（非小细胞肺癌）分子学检测的临床价值、NSCLC分子学检测的实践问题、NSCLC分子学检测进展以及罕见突变靶向治疗研究。
一、NSCLC分子学检测的临床价值
20年间NSCLC靶向治疗与检测发展迅猛
最早说到靶向治疗，会提到EGFR抑制剂，早在年，EGFR抑制剂就已经进入到临床研究阶段；年，肺腺癌中发现对吉非替尼/厄洛替尼敏感的EGFR突变，在年，肺腺癌中证实吉非替尼疗效优于化疗。从年到年，用了12年的时间。
但是ALK重排从年被发现，到年第一代ALK抑制剂-克唑替尼用于临床，时间的跨度更快了。年，克唑替尼在ROS1+NSCLC中疗效被证实；年，临床研究证实在ALK+NSCLC一线治疗中，阿来替尼优于克唑替尼。
非小的时间轴中尽管有化疗的进展，抗血管生成药物的进展，但在NSCLC在治疗进展中的源头，靶向的药物和基因突变带来了整个系统的发展。
靶向治疗不断提升EGFR+NSCLC患者生存获益
在临床治疗的疗效方面，ENSURE、IPASS、WJTOG以及NEJ是我们最早接触的厄洛替尼和吉非替尼用于晚期EGFR+NSCLC的临床演讲。一代TKI单药使用时，中位PFS（月）大概是8~9个月。随着二代TKI出现后，整体单药使用的中位PFS（月）较前一代TKI略有上升，LUX-Lung3为13.7个月，LUX-Lung6为8.3个月，达克替尼为12.3个月。而三代TKI的奥希替尼主要是针对TM突变，但是在一线治疗中的PFS也达到14.4个月。
在这个前提的基础上，A+T的模式，即抗血管生成药物贝伐珠单抗（A）和一代靶向药厄洛替尼（T）同步联合，NEJ的PFS达到17.4个月，ARTEMIS的PFS达到19.5个月。
所以，从一代TKI到二代TKI，再到三代TKI；以及优化A+T同步联合，在把晚期NSCLC，尤其是EGFR+NSCLC的治疗生存获益一点点在提高，当然这也是由于精准检测、精准治疗带来的结果。
靶向治疗不断刷新ALK+NSCLC患者无进展生存
克唑替尼（PROFILE）的一线治疗的PFS为10.9个月，这是在多个实验中被证实，包括在临床中。而在克唑替尼进展后的二线治疗中，塞瑞替尼（ASCEND-5）的PFS为5.4个月，恩莎替尼（eXAT）现在还没有完全上市，PFS为9.6个月，阿来替尼（ALUR）的PFS为10.9个月，Brigatinib(ALTA-2)的PFS为16.7个月。如果把二代药物Brigatinib（ALTA-1L）放在一线治疗，PFS为24个月；如果把阿来替尼（ALEX）放在一线治疗，PFS长达34.8个月。
分子学诊断已成为NSCLC规范化诊疗重要环节
CSCO指南、NCCN指南、ESMO指南、日本肺癌学会等国内外诸多指南制定方将分子学诊断作为NSCLC诊断的重要组成部分，把NSCLC作为综合治疗模式进行管理，其中必须要有分子分型、疾病分期、病理类型，为治疗方案拟定与调整提供不可或缺的依据。
NCCN指南ALK阳性NSCLC治疗变迁
NCCN指南的变迁非常快。在年1月，ALK融合的一线治疗，克唑替尼是一类证据；6月，在此基础上增加了阿来替尼，做为一类优先的推荐方案至今。年以后，在NCCN指南中一线治疗中增加了brigatinib。另外，对于二线以及后续的治疗也有相应的流程，这种流程也是基于循证医学证据来指导。
CSCO指南ALK阳性NSCLC治疗变迁
CSCO指南是中国的指南，在治疗指导上都是遵循循证医学证据的。年与年的ALK阳性NSCLC一线治疗的基本模式变化不大。年，随着证据增多以及阿来替尼在中国适应症的获批，阿来替尼是做为1A类证据（优先推荐）。总体来看，CSCO指南的证据级别的更新以及推荐药物选择的不同，也体现了整个NSCLC精准检测与治疗的认识的过程。
现阶段已有明确意义的NSCLC分子分型
NSCLC分子分型可以分为三大类。第一，可指导治疗的基因突变，目前知道我们有EGFR突变，包括外显子19缺失、外显子21突变(LR)、外显子18突变、还有ALK融合和ROS1融合，这些不仅推荐，并且在我国批准的药物。第二，具有临床意义的基因，比如KRAS、RET、BRAFVE、cMET、HER2、NTRK融合，这部分基因叫做临床意义的基因，但是可能在我国并没有批准的药物。第三，与疗效存在一定相关性的biomarker，比如PD-L1、TMB，这仅涉及到一部分。在NSCLC分子分型时，在检测的时候，这些情况要考虑在内。
二、NSCLC分子学检测的实践问题
NSCLC患者何时接受分子学检测？
NSCLC患者目前需要进行分子学检测的情况主要有三类：
第一，诊断为晚期NSCLC（包含早期疾病进展为IV期NSCLC），确诊后立刻进行分子学检测，尤其是Ⅲ期和Ⅳ期。检测突变类型分为两种，一种是常规检测，有药物指导意义的如EGFR突变（外显子18、19、21）、ALK融合、ROS1融合，这必须检测的，各种指南推荐，有相应的药物治疗，并且用药后的临床疗效非常好；另一种是非常规检测，比如BRAF/RET/HER2/KRAS/MET。
第二，I-III期N1/N2，如果术后明确为N1/N2应检测，检测突变类型推荐是EGFR突变，尤其对于N2而言，有EGFR突变的话，术后辅助治疗EGFR-TKI作为推荐治疗。
第三，靶向治疗失败，TKI治疗中发生疾病进展，这时要再次检测突变类型，相当于是动态检测。假如是1/2代EGFR-TKI治疗失败，首先考虑进行EGFRTM检测，其他的检测也尽量包含在内；ALK-TKI治疗失败后，是否需要再次进行ALK突变检测目前尚无充分证据，根据临床的需要以及取得标本的情况来确定。
简单来说，我认为NSCLC患者目前需要进行分子学检测的三个时机需要分别掌握，你所检测的病人和标本以及需要检测的基因和基因类型。
例NSCLC患者（十基因）分布情况
医院单中心总结的一小部分数据，有关例NSCLC患者（十基因）的分布情况。从中我们可以看到EGFR基因占比53.33%，ALK基因占比5.67%，KRAS基因占比12.67%，其实在很多类似的研究中发现KRAS基因占比并不少，但是并没有有效地应用药物。BRAF、HER2、MET所占比例并不是很高。另外，还有一部分情况叫做符合突变或共存突变。是否所有NSCLC患者均为分子学检测对象？
「CSCO原发性肺癌诊疗指南」中推荐，所有含腺癌成分的NSCLC，无论临床特征，均应进行分子学检测；肺鳞癌患者：对于从不吸烟、小标本（非活检）患者也应考虑进行分子学检测。「NCCN指南」推荐在腺癌、大细胞肺癌、非特定类型NSCLC应进行分子学检测；肺鳞癌：从不吸烟、活检样本小、混合组织类型应考虑分子学检测。「CAP/IASLC/AMP肺癌患者TKI靶向治疗筛选指南」中推荐，对于除腺癌之外的组织类型，如临床特征高度提示存在癌症驱动基因（如年轻、从不吸烟），可进行分子标志物检测。这些不同的指南中突出的特点是强调腺癌应进行分子学检测，对于鳞癌或者肺鳞癌、从不吸烟的小标本等也推荐分子学检测。
为什么这样推荐？NSCLC敏感基因富集于肺腺癌群体。而鳞癌中相对占比较少，鳞癌中56%找不到驱动基因，而其他相对比较常见的基因比如PIK3CA所占10%，FGFR1Amp能达到20%。
注：CAP：美国病理医师学会，IASLC：国际肺癌研究学会，AMP：分子病理学会。
例NSCLC患者临床特征
我们分析了一下这例NSCLC患者，腺癌占比94%，鳞癌占比4.67%，其他类型占比1.33%。这项研究中也是腺癌所做的分子学检测更多一些。
什么是NSCLC分子学检测的最佳取样方式？
临床研究中NSCLC突变检测有多种取样形式，比如肺活检、淋巴结活检、支气管肺泡灌洗、体腔积液等。
在临床研究中标本的来源也是多种多样。对于呼吸科而言，我们最常用的就是支气管镜，适用于中央型、较大病灶的活检取样；与支气管内超声结合，如EBUS-TBLB，EBUS-TBNA；EBUS-TBNA侵入性更小，准确性可比肩纵隔镜。对于伴胸水患者，胸腔穿刺采集胸水进行细胞学检查。如果有外周型病灶，需经CT引导胸腔皮下细针抽吸，存在一些局限性，可导致气胸风险，对于不良反应、适应症的问题，会有相应的处理方式。如果以上方法均无法实现准确取样、诊断时，考虑使用外科方法活检取样。
例NSCLC患者标本来源
82.33%来源于组织标本，9%来源于胸腔积液的细胞学标本，8.67%来源于血的标本。一般情况下，推荐在初治的患者中，尽量获取组织标本来进行基因检测，因为相对于血液标本而言，组织标本的敏感性要高。
经支气管镜腔内活检时，组织取材量多少为宜？
支气管镜是我们呼吸科最有力的「一把斧」。一般3～4次活检诊断阳性率70～90%，增加活检次数，诊断阳性率不会再随之增加。5次活检，可获得理想的诊断率及更为精确的亚分型诊断及分子学检测结果。建议：若无ROSE，至少行3～4次活检，以保证所得肺组织样本能够进行病理及分型诊断，剩余样本可适当保存，以供额外的分子学诊断等用途。
活检的次数，随着术者的习惯、患者病灶的大小、有无并发症、出血量多少等来确定；因为现在的组织标本除去用于病理的诊断、EGFR、ALK、ROS1，有可能随着诊断的深入，需要的标本量越多，并且需要进行检测的数据也多，所以根据自己的习惯以及病情来确定活检次数。
现有经气道导引定位技术在肺外周病灶取材中的价值如何？
由于电磁导航的引导鞘价格高昂，而较细或超细支气管镜可部分代替引导鞘定位功能，因此，可用较细或超细支气管镜联合径向超声引导。普通光镜结合荧光/窄谱技术，可提高活检部位的准确性。仔细研读胸部CT，根据影像学图像中支气管走向及其与病灶的关系，在相应肺段各亚支行TBLB也可提高活检成功率。
经支气管镜活检时，多种采样方法联合的诊断价值更高？
一次检查中多种采样方法联合应用的诊断价值高于单一方法，如刷检、钳检、针吸、冲洗等。哪几种联合为好，要根据病变的位置、设备条件及操作者的技术水平决定。一般以2～3种为宜，再多既耗费时间，又增加并发症的发生风险。
活检钳的类型和尺寸对经支气管活检的诊断效能有无影响？
无研究表明哪种类型活检钳在中央支气管病变活检中更具优势，甚至活检钳尺寸对气管内肿瘤活检诊断的影响也缺乏相应研究评估。活检钳的选择通常取决于术者的经验和习惯。一些学者认为，大活检钳取得的组织标本较大，但是并无研究表明大活检钳可提高诊断效能。
可活动锯齿缘鳄口活检钳、普通锯齿缘鳄口活检钳、标准型活检钳、带针椭圆型活检钳
支气管刷检时，对操作技术和标本处理有无特殊要求？
细胞刷有带护套和不带护套两种，在诊断效率上无明显区别。推荐使用一次性细胞刷，以避免交叉污染和感染的发生。对刷检获得的细胞学标本，可直接涂抹到玻璃片上，也可将毛刷置于生理盐水中剧烈摇晃，将细胞洗脱于液体后，进行离心和收集。尚无研究证实这两种方法的优劣。
对同一患者进行BAL、经支气管刷检及活检术时，操作顺序如何？
刷检的局限性在于只能取黏膜表面的细胞标本。先使用毛刷取样，可减少血液对细胞学检查造成的影响。
BAL+活检/刷检，顺序有争论。有研究显示，BAL在活检/刷检前或后，均无影响；可视病灶：BAL与刷检效能相近，活检联合其中一项即可；非可视病灶：活检联合BAL取样。
可暂将BALF保留，当其他标本的检查结果为阴性时，再送检。但对肺部弥漫浸润性改变的恶性肿瘤，BAL具有较好的诊断价值。
TBNA与EBUS-TBNA
这是一项纳入33项临床研究的荟萃分析
其结果表明EBUS-TBNA极大可能保证足够样本量的获取，尤其是管腔以外的不可视的病灶可能需要借助于TBNA或EBUS-TBNA取得足量的病灶。
在亚洲人群亚组分析中，我们得知EBUS-TBNA取样98.9%可获得用于EGFR突变检测足够样本量。
总体分析：EBUS-TBNA取样94.9%可获得用于ALK突变检测足够样本量。也就是说EBUS-TBNA在我们的标本取材以及分子学检测中的诊断效果非常高。
该研究建议最小穿刺数：3（经ROSE验证）或4（无ROSE验证），仍然要根据病变的大小、操作者的习惯以及患者的危险度来决定穿刺数量。
如何选择合适的穿刺或活检工具？
21G或22G穿刺针适用于获取细胞学标本，样本的获取数量和质量，以及肺癌的诊断率均无差异。18G或19G穿刺针一般用于常规TBNA，可获得较大的核心组织样本，能提高诊断的准确率。不推荐常规使用EBUS引导下的钳夹活检；但对一些特定疾病，如淋巴瘤、肉瘤等，可采用该活检技术。在进行TBNA或EBUS-TBNA时可由操作者根据穿刺活检部位及其血供情况，酌情选用。
推荐对患者采取何种镇静或麻醉方式？
镇静包括轻度镇静、中度镇静（即清醒镇静）、深度镇静和全身麻醉。全身麻醉或清醒镇静对EBUS-TBNA诊断的敏感性、特异性、操作时间及患者耐受性等方面均无差异；但清醒镇静的患者发生轻度操作相关并发症的几率略高。清醒镇静和深度镇静相比，对操作的各方面也无明显影响。因此建议根据患者实际情况、意愿，医院条件选择适合的方式。EBUS-TBNA时选择理想的镇静方式，有助于操作者获取理想的标本，增加患者舒适度，减少操作相关并发症发生。
获取的样本是否需要特殊的处理或染色？
TBNA样本包括细胞涂片、制作细胞团块、核心组织。细胞学涂片可用于病理学诊断。可将ROSE的细胞涂片脱色后，用于进一步的细胞学评估、免疫组化染色或分子病理学检测。细胞团块和核心组织可用于组织学检测，推荐将部分活检样本保存于特定溶液（如福尔马林、生理盐水或Hank溶液）中，以备制作细胞团块，用于免疫组化和分子学检测，获得更精细的组织学和分子分型。
对细胞玻片的处理和染色方法，常用方法包括液基细胞学处理、吉姆萨染色。
获得的标本是否可用于分子学检测？有哪些影响因素？
绝大多数细胞学样本均可用于分子学检测，但依赖于样本中肿瘤细胞的绝对数（＞个）、所占比例、保存的程度，以及检测方法的敏感性。如果要进行分子学检测，建议平均抽吸活检4次。细胞团块和核心组织样本更适于基因突变分析和ALK检测；如负荷不足，可选用细胞学玻片来检测EGFR等基因突变。ROSE有助于评估靶病灶样本中肿瘤细胞负荷，因此如需进行分子检测，推荐使用ROSE。
经皮穿刺肺活检（transthoraciccoreneedlebiopsy）
除了支气管镜取得中央气道标本之外，对于外周病变而言，可以通过经皮穿刺肺活检。
经皮肺穿活检术能活检多大结节？
根据病灶在胸部影像学上的表现可设定顺畅的进针轨道，穿刺结节的大小无明显限制，小于1cm的结节，穿刺的假阴性率明显上升。因此，经皮肺穿刺活检依赖于操作者的技术水平、影像科定位及病理科检测的敏感性，建议操作科室（呼吸科或肿瘤科等）、影像科及病理科多学科联合制定。
穿刺后如何处理？
患者的处理：建议穿刺后即刻CT扫描，可观察出血量及有无气胸。建议患者操作后绝对卧床24h，根据出血量和气胸情况，予以止血药物和吸氧；根据临床症状和体征行心电监护。
标本的处理：组织标本建议行10%甲醛固定，FNA标本建议装至新柏氏液内，送检病理科进行相关检查。FNA时若进行ROSE可明显增高诊断的阳性率；若标本暂时无法送至病理科，可考虑4℃放置过夜，尽快送至病理科以防止组织细胞降解。
各类细胞学样本优缺点比较
多部指南肯定细胞学样本的分子学检测价值
CSCO：原发性肺癌诊疗指南
对于MPE或心包积液等细胞学样本在细胞学数量充足条件下可制备细胞学样本蜡块；考虑到细胞学样本数量少等特点，细胞学标本的检测结果解释需格外谨慎。NCCN指南：NSCLCV3
在仅能获得细胞团块，或该类型样本为最佳取样时，高度推荐采用该类样本。CAP/IASLC/AMP肺癌患者TKI靶向治疗筛选指南
病理科医师可采用细胞团块或其他细胞学制备样本进行肺癌生物标志物分子检测，但该类样本不同于组织样本及血样，应对不同的样本类型实施验证研究。细胞蜡块技术在胸腔积液诊断中的应用
我们科的一名学生做的部分研究。把胸腔积液离心、沉渣梯度脱水，然后包埋做了细胞蜡块，染色以后，观察到细胞蜡块组的形态特点与组织标本相似。所以，对于取不到组织标本的患者而言，细胞蜡块技术是个很好的替代。
外周血样是否可用于NSCLC分子学检测？
一般情况下，不推荐cfDNA用于首次诊断肺腺癌患者的分子学检测，相对来说它诊断的效能和效价比较低，因为敏感性相对说较差，并且是一项需要阳性率较高的检测技术。但是在一些临床情况下，组织活检取材有限或不足以进行分子学检测，可使用cfDNA明确EGFR突变。对于肺腺癌患者接受EGFR-TKI后发生疾病进展或继发性耐药，可使用cfDNA明确是否存在EGFRTM突变；如血浆样本检测结果为阴性，推荐使用肿瘤样本再行检测，以防止假阴性从而影响后面的治疗效果。
cfDNATM检测可有效指导奥西替尼治疗
自奥西替尼首个临床I期研究（AURA研究）中例NSCLC患者，伴EGFR敏感突变，且EGFR-TKI治疗后发生耐药。收集患者血浆，利用BEAMing进行cfDNA测序明确TM状态，并与肿瘤组织检测结果进行比对。分析比较EGFRTM+/-患者ORR、PFS。
研究发现，组织与血浆TM+患者PFS一致；血浆TM-患者利用组织验证真实突变状态，TM+同样显著获益。
三、NSCLC分子学检测进展
各指南推荐的分子学检测方法
这些指南推荐的分子学检测方法大同小异，但是主要体现在常用的EGFR和ALK这两个靶点，注意判断结果的时候看看使用了哪种检测方法。
NGS原理：全基因组深度测序
现在NGS使用的越来越广泛，无论是组织标本、细胞标本或者血液标本，尤其是DNA。IHC、FISH、实时PCR、Sanger测序等方法均为特定靶基因检测（需使用特定抗体、引物等）。NGS为全基因组深度测序，可同时检测多个基因的多种突变形式。
对于临床医生而言，不仅要知道NGS的原理，有关标本的来源和标本的解读，对大家来说更有意义。
NGSvs其他传统检测方式
NGS具有灵敏度高、多基因、深度测序的优势。
NGS在NSCLC临床诊疗中的应用
NGS从原理上来说，取样、自动化DNA提取、自动化文库构建、测序以及数据对与解读，这是从实验室层面需要做的工作。NGS方法在临床上可以根据测序结果进行分子学分型，辅助诊断；另外，根据分子学特征选择靶向治疗药物（如TKI）；更主要是在治疗过程中监测耐药突变的出现，指导方案调整。因此，无论在诊断、治疗以及动态监测中，NGS都起到很重要的作用。
全球局面及国内NGS产品批准情况汇总
NMPA：cFDA于年9月1日正式更名为NationalMedicalProductsAdministration，国家药品监督管理局。
目前NMPA批准的都是小Panel试剂盒，目前还没有对NGS大Panel的获批，因为大Panel涉及到的基因广泛，需要进行有效的临床验证，而二代测序的中国专家共识也认为，NGS大Panel在应用到临床前应进行充分的临床验证。大Panel的审批必定是将来的趋势。
NSCLC突变靶点富集于肺腺癌：仍存在大量有待明确治疗价值的突变类型
这是中国的一项研究：纳入例肺腺癌、例肺鳞癌、57例肺腺鳞癌、8例肺肉瘤样癌分析NSCLC驱动基因分布情况。
肺腺癌中的基因情况主要有EGFR、ALK、ROS1、RET、HER2；肺鳞癌中相对说未知的基因更多一些；大细胞癌和肺肉瘤癌相对来说我们知道的基因更少。所以，刚提到这些突变靶点更加多的富集是肺腺癌。但是即便对于少数驱动基因「全阴性」肺腺癌，仍可检测到EGFR胞外结构域的罕见突变。这个「罕见突变」，我们可能现在对它的功能和情况不认识，但是随着标本或者经验的积累，可能在某一天就出现一个新的基因。
NSCLC真实突变情况可能更为复杂
LCMC2研究：肺腺癌患者常出现共突变情况
下图的饼形图是一项纳入例NSCLC患者的研究，其中有1/3以上的患者存在共突变，检出一个基因突变的占比64.17%，有两个基因突变的占比26.74%，有三个基因突变的占比6.15%，三个以上基因突变的占比2.94%。所以，共突变也是在我们在诊治过程中要面临的问题，可能在靶向治疗选择的时候会更加困难。
例NSCLC患者（十基因）分布情况
这是刚才展示过的例NSCLC患者的基因，除了单一突变基因外，还有EGFR合并PIK3CA、EGFR合并HER2、EGFR合并BRAF、EGFR合并MET等。所以也看到了共突变，那么这些患者的治疗中可能带来了治疗效果的差异，以及治疗的选择上需要参考分析。
NGS大幅拓展NSCLC精准治疗体系
四、罕见突变靶向治疗研究
NSCLC罕见突变靶点—cMET
cMET激活后的下游信号通路，包括RAS/MAPK，P13K/AKT通路，以及Rac/Rho通路，该通路与促进细胞增殖、存活以及转移相关。cMET扩增作为一个独立驱动因子（3%－5%）会造成EGFR抑制剂耐药，大约20%的NSCLC患者接受EGFR靶向治疗后复发也与此有关。
注：Met14外显子扩增或者跳脱突变，Cmet是由met基因编码出来的蛋白。
NSCLC中的MET基因异常有以下三种表达形式
一般认为MET可以作为主要驱动基因，主要是MET基因扩增和MET第14外显子改变；MET还可以作为次要/共驱动基因，往往在EGFR突变的患者，EGFR耐药以后的原因就出现了MET基因扩增。
MET抑制剂
MET抑制剂现在有Capmatinib、克唑替尼、Tepotinib，这些是我们对这个罕见突变靶点最近一两年
