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细针穿刺
细针穿刺细胞学是在病变组织（皮肤损伤、淋巴结、胸腔及腹腔肿物）以及体腔液检查中十分常用的检查手段。该方法可操作性强。
操作所需基本工具如下：
◆带有磨砂面的载玻片，有助于进行标记。
◆5mL注射器（如果需要，也可以使用2mL或者10mL注射器；对于非常坚固的肿物，10mL注射器可能会更适用）。
◆20-22G针头。
◆用铅笔在载玻片上标记日期、病变部位以及患宠名字。注意：使用圆珠笔或者记号笔进行的标记，很有可能会被含有酒精的染液冲洗掉。
对于某些器官，例如肝脏或者脾脏，通常需要较长的针头，尤其是大型犬。这里推荐使用带有套管针的骨髓穿刺针来进行操作，避免受到邻近肿物或器官的组织污染（对于一些软组织，可以使用较小的针头和注射器）。
细针穿刺技术可采用“负压穿刺技术”或者“非负压穿刺技术”两种方法。对于血管丰富的肿物或者器官（如脾脏、肝脏），为了减少血液的污染，可以采用非负压穿刺技术进行样本采集。总而言之，整个样本采集过程不应超过5-10s，且需要制备数张涂片。
▲穿刺技术：
①用一只手固定肿物或者器官（如外周淋巴结），另一只手持注射器将针头插入肿物或器官（图1-1）。对腹部器官或者肿物进行细针穿刺时，如果可能，最好在超声引导下进行。
图1-1使用带针头的注射器进行细针穿刺②跟静脉穿刺一样，操作前需要对皮肤进行消毒。③连接注射器的针头必须刺入病变组织内部。④向外抽出活塞，保持负压，针头可以在肿物或者器官中不同部位进行穿刺。⑤放开活塞后，即可取出连接注射器的针头。⑥注射器吸入大概3-5mL空气，并且重新连接针头，将针头内的穿刺液轻轻吹到载玻片上。⑦注意：对肿物或者器官进行穿刺时，用一只手保持负压比较困难，商品化的穿刺枪就比较有用，可以帮助拔出活塞，并且可以简单地用一只手保持负压（图1-2）。图1-2使用穿刺枪进行细针穿刺（德国菲恩海姆Scil动物保健公司供图）▲非负压穿刺技术：有两种方法可以应用于样本采集。①单针技术：未连接注射器的针头插入已消毒的皮肤病变内（图1-3），在组织中快速来回移动针头大概十次后，撤出。将含有3-5mL空气的注射器连接针头，快速地将针头内的穿刺液吹到载玻片上。图1-3单针非负压穿刺技术，
适用于从小病变组织如脓疱或者大疱中获取样本
②第二种非负压方法，是针头进针前已经与含有2-3mL空气的注射器相连（图1-4）。带有注射器的针头在组织内前后快速移动，然后拔出。将吸出的病料吹到载玻片上，并迅速制作成涂片。图1-4使用连接有注射器的针头实施“非负压细针穿刺技术”，在超声引导下对患有腹水及黄疸的犬进行脾脏样本采集。注意注射器中已经预先吸入空气，并且用拇指及食指持住注射器2
触片
可以用制作血涂片的方法（图1-5）或使用压片制备技术（图1-6）制备细胞学涂片。图1-5使用血涂片技术制备涂片。(A)通过注射器和针头推出3-5mL空气，将针头内采集的样本吹到载玻片上。(B)另一张载玻片呈45°角（对高黏性的液体如关节液，建议大约25°角）在载玻片上缓慢移动，直至与样本材料接触。(C和D)待所采集的材料沿着载玻片的宽度自动散开后，将载玻片平稳且快速地向前推进。图1-6压片制备技术。(A)通过注射器和针头推出3-5mL空气，将针头内采集的样本吹到载玻片上。(B)把另一张载玻片轻轻地放在第一张载玻片上，在毛细作用下两张载玻片互相黏附。(C)上层载玻片沿着含有样本的载玻片慢慢移动。(D)上层载玻片（推片）移动到下层载玻片的末端，然后可以进行细胞学检查。湿润的组织表面（如活检组织、皮肤溃疡或者渗出性病变）可以用于制作触片，干燥的皮肤病变也可以通过使用透明胶带制作触片（图1-7及图1-8）。在洁净的载玻片上制作触片之前，需要用干拭子或者纸巾将活检组织表面过多的血液或者组织液清理掉。触片法的缺点：该方法只能获取病变组织表面的细胞，并不能获得深层的病理组织，并且细胞量少，易受细菌污染。图1-7肝脏活检组织的触片制备技术。
(A)在制备触片之前，用滤纸吸去活检组织上多余的血液。
(B和C)用活检组织的表层触压载玻片上不同位置，来制备触片。
图1-8透明胶带法。(A)把一条透明胶带在皮肤患处按压几次。这种技术是观察皮肤表面微生物（细菌、酵母菌）的理想方法。然而为了评估细胞，其他技术例如制作皮肤刮片的罗曼诺夫斯基染色是比较好的方法。像虱子和姬螯螨这样的寄生虫可被非染色的胶带法检查到。(B)为了制备罗曼诺夫斯基染色的透明胶带触片，首先将带有所采集材料的胶带像一个倒扣的“U”形（黏性的一面朝下）置于载玻片上，不用固定就可以染色。染色后（另外同时准备一条不染色的透明胶带触片）将胶带平放在载玻片上，可以在显微镜下观察。3
刮片
对于坚硬的病变组织，其脱落细胞很难用细针穿刺技术获得。刮片法比较适用。病变部位清洁及干燥后，手持大手术刀片（90°角持刀），朝向操作者方向，刮取样本材料，重复数次。把手术刀片上刮取的材料转移到载玻片上，并用手术刀片涂布均匀，或使用另一张载玻片来制备压片，通过前文提到的压片技术进行制片。4
拭子涂片法
拭子涂片法主要适用于从痿道、阴道或耳道采集的样本（图1-9）。它们对肿瘤的诊断作用不大（缺点类似于触片法）。图1-9通过棉拭子采集耳道样本进行细胞学检查。
(A)棉拭子收集耳屎或者分泌物。
(B)把棉拭子上的采集样本涂抹到载玻片上。
(C)注意棉拭子是曲折移动的。
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刷取法
用细胞刷采集刷取物（图1-10）与灌洗取样、压印取样或者棉拭子取样相比，采集的样本更能代表深层病变。通常用于结膜、呼吸道或阴道部位的样本采集。图1-10结膜细胞刷取样。把带有样本的细胞刷在载玻片上滚动。注意：犬在取样前需接受眼部麻醉。6
细胞学检查中液体样本的采集及处理
细针穿刺时要把患部周围的毛发剪掉并且对皮肤消毒。如果在没有超声引导的情况下进行腹腔穿刺术，需要在脐后2cm处的腹白线处取样。没有超声引导进行胸腔穿刺时，应该在胸腹侧壁第六和第八肋骨之间进行。针插入肋骨前缘，以避免损伤神经或血管。若大量的液体被吸出，应该把医用三通阀连接到注射器的轮轴处防止气胸的发生。常规情况下液体样本中应该放入EDTA（乙二胺四乙酸）（如果需要进行细菌培养，也可放入普通无菌空白管中）。取出的样本应该在30min内完成涂片以免因细胞老化而出现伪像。对于细胞含量较少的液体（如：支气管肺泡灌洗液、脑脊液），使用细胞离心涂片器可以取得比较好的效果（图1-11）。对于体腔液（腹腔积液、胸腔积液和关节液）直接涂片就可观察细胞结构。此外，若细胞数偏低（例如10.0×10^9/L），建议使用细胞离心涂片器制片，便于观察细胞类型。但在实际工作中，没有细胞离心涂片器时，样本放入样本室，通过“内部”沉淀来制片（图1-12）。图1-11(A)这张照片展示了用于细胞离心法制备细胞离心涂片的玻片夹、载玻片、样本室和过滤卡。(B)使细胞离心涂片器样本室内充满液体，离心力18g，离心3min。在细胞离心涂片器样本室挪动前用带有针头的注射器吸走上清液，并且把涂片置于干燥离心机上，离心力90g，离心1min。(C)染色的细胞离心涂片。图1-12(A)如果无细胞离心涂片器，可以使用注射器（根据所获得的液体的体积，选择一个10mL或1mL的注射器）、心电图钳和滤纸（如果没有滤纸，可以使用三层的咖啡滤纸，剪一个比注射器的内径稍大的合适的圆孔）制作一个内部沉淀样本室。(B)截断的注射器筒通过心电图钳与载玻片及滤纸紧密固定，然后加入液体样本（50-μL）。等待细胞沉淀1h，然后用连接针头的注射器吸掉上清液，并除去涂片器。虽然制片质量不如内部沉淀法和细胞离心涂片技术，但是也可通过离心沉淀制作涂片，其离心力g，离心5min，离心后去除上清液（倒入水槽或用移液管吸出），管中剩余少量（1-2滴）液体。混匀沉淀及剩余液体,用血涂片方法或划线浓缩技术制备涂片。7
书籍介绍
本文内容摘自《犬猫细胞学诊断手册》
本书综述了各类诊断样本的采集技术以及细胞学结果判读的一般原则，以简明清晰的方式介绍了临床实践中常见的病变及相关疾病。本书非常注重高质量的彩色图片的应用。尽量在图题中描述相应病变，以减少正文中不必要的赘述内容。为提高使用效率，本书将参考文献和推荐读物单独列出，读者可在需要时进一步查阅相关信息。本书主要适用于有志于提升自己犬猫细胞学诊断相关知识的小动物临床医生以及兽医专业在校学生，同时本书对临床病理住院医生也很有帮助。（购买书籍，了解更多犬猫细胞学知识）（购买课程，化验小白的轻松逆袭~）
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本期摘自《犬猫细胞学诊断手册》校对
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